p>De retour en France, Champlain s’évertue à solliciter le soutien au projet colonial de la Nouvelle-France. Sans le soutien du roi et des investisseurs, l’exploration et, in fine, la colonisation relèvent de la gageure. Le roi doit être convaincu de l’influence positive du projet sur la souveraineté et les intérêts économiques de la France. Quant aux investisseurs, ceux-ci doivent être assurés de recueillir des bénéfices et disposer de la garantie que leurs subventions se traduiront à long terme par des avantages financiers.

Champlain et Pierre Du Gua, sieur de Monts, devenu lieutenant-général de la Nouvelle-France en 1603, travaillent de conserve pour solliciter auprès des investisseurs et des personnages importants de la cour française le soutien nécessaire à la colonisation de l’Acadie. Le sieur de Monts parvient à constituer le capital nécessaire au voyage et invite Champlain à l’accompagner en Acadie au début de l’année 1604. Ils quittent la France le 7 avril.

Plusieurs colons les accompagnent, notamment Jean de Biencourt, sieur de Poutrincourt, et de nombreux ouvriers utiles à l’exploration et à la construction en Acadie. Interprète d’origine africaine, Mathieu Da Costa fait également partie de l’expédition. Il est considéré comme le premier Noir à avoir foulé le sol canadien. Deux prêtres catholiques et un pasteur protestant sont également recrutés pour ce voyage en Acadie. Cette situation reflète bien la politique religieuse du roi, qui favorise le catholicisme en tant que religion universelle, tout en prônant la tolérance à l’égard du protestantisme et le souhait partagé d’évangéliser les Autochtones.

Champlain et ses compagnons arrivent en Acadie au début du mois de mai 1604, où ils entreprennent sur-le-champ de repérer un site idéal afin d’y fonder un établissement. Champlain met à profit ses compétences de géographe et de cartographe pour examiner de près la côte atlantique, la baie de Fundy et la vallée de l’Annapolis. Il est finalement décidé de fonder le premier établissement sur une île située près de l’embouchure de la rivière Sainte-Croix, à la frontière actuelle entre le Nouveau-Brunswick et le Maine. Cet emplacement paraît idéal en été; en revanche, dès le milieu de l’hiver de l’année suivante, la situation se dégrade terriblement. La glace brisée de la rivière Sainte-Croix isole l’établissement du continent et les vivres se révèlent insuffisants pour lutter contre le froid et la menace de malnutrition et de maladie. Plusieurs hommes périssent et, au printemps 1605, peu de colons sont encore en bonne santé.

Le premier établissement en Acadie fait figure de catastrophe. Au printemps 1605, le sieur de Monts opte pour un autre site d’établissement. Les préparatifs destinés au transfert de l’île Sainte-Croix à Port-Royal, près de l’actuelle ville d’Annapolis Royal en Nouvelle-Écosse, vont bon train. Entre 1605 et 1607, les colons s’emploient à établir une nouvelle colonie à Port-Royal. Plusieurs bâtiments sont érigés et plusieurs potagers sont aménagés. En juillet 1606, le sieur de Poutrincourt, gouverneur de Port-Royal, recrute 50 nouveaux colons.

Les colons de Port-Royal sont encouragés à œuvrer collectivement pour la colonie et individuellement pour leur profit personnel, ce qui donne lieu à un système d’entreprise mixte qui distingue Port-Royal de toute autre colonie nord-américaine de l’époque. De nombreux efforts sont également déployés afin d’établir de bonnes relations avec les Autochtones. Particulièrement désireux de cultiver des relations commerciales positives et de nouer une alliance contre leurs ennemis, les Micmacs apportent une assistance appuyée aux Français dans l’établissement de leur colonie.

Champlain et ses compagnons parviennent également à dégager des solutions pour permettre à la colonie d’affronter l’hiver rigoureux. La musique et le divertissement ont leur place à Port-Royal. Au cours de l’hiver 1606-1607, Champlain fonde l’Ordre de Bon Temps : à tour de rôle, chaque colon qui dîne avec le gouverneur Poutrincourt se voit confier une fois toutes les deux semaines l’organisation d’un festin et d’une soirée de divertissement. Cette initiative remporte un franc succès et permet à la colonie de passer l’hiver et de cultiver des relations positives avec les Autochtones, puisque nombre de ces derniers dînent à la table de Poutrincourt.

En mai 1607, les colons de Port-Royal sont informés que le sieur de Monts perd son monopole de la traite et sont contraints d’abandonner la colonie puis de retourner en France. Malgré la défection de 1607, Port-Royal continue de jouer un rôle dans les efforts de la colonisation française pendant toute la première moitié du XVII^e siècle. Champlain préfère quant à lui porter ses efforts vers la vallée du Saint-Laurent, où il retourne au printemps 1608.