Lorsque Champlain retourne à Québec en 1633, il découvre les ravages de l’occupation anglaise et entreprend sans plus tarder de reconstruire et de réparer ses structures de défense, de commerce et d’habitation. Il fait également édifier une nouvelle chapelle, qu’il baptise Notre-Dame-de-la-Recouvrance.

Sur le plan spirituel, de nombreux efforts sont déployés pour ranimer la ferveur religieuse au sein de la colonie et Champlain cultive les relations de soutien et d’amitié avec plusieurs pères jésuites. Il travaille également à rétablir les relations rompues avec ses alliés autochtones. À l’été 1633, de nombreux Hurons-Wendat se rendent à Québec avec une quantité importante de fourrures qu’ils souhaitent vendre aux Français, ce qui procure à la colonie des profits importants au cours de cette année. Dans l’espoir de préserver le commerce contre toute intrusion ou attaque des nations iroquoises (haudenosaunees), Champlain fait construire un fort à Trois-Rivières, dans l’embouchure de la rivière Saint-Maurice, en 1634. Le fort permet également de s’arroger l’exclusivité du commerce avec les nations algonquines (anishinabegs), qui pourraient traiter avec les Anglais si elles étaient contraintes de voyager jusqu’à Québec pour faire du commerce avec les Français.

La colonie constitue également une priorité; aussi, au cours de cette période, la vallée du Saint-Laurent est divisée en seigneuries, c’est-à-dire en bandes de terre longues et étroites s’étendant à partir des rives du Saint-Laurent. Ce système de répartition des terres a pour objet d’encourager les personnes qui en ont les moyens à assumer le risque financier du recrutement de colons pour cultiver la terre, et ainsi de contribuer au développement et à la croissance d’une colonie agricole réussie.

À l’automne 1635, Champlain tombe malade et passe ses derniers jours à Québec à mettre ses affaires en ordre et à réaffirmer sa foi catholique. Il meurt le 25 décembre 1635, pleuré par tous les membres de la colonie et par ses alliés autochtones. Son engagement sans faille en faveur de l’établissement d’une colonie française permanente en Amérique du Nord lui vaut une place dans l’histoire.