À l’été 1620, Champlain retourne en Nouvelle-France à bord du Saint-Étienne, accompagné pour la première fois de sa femme et jouissant de l’autorité et du soutien de la couronne française.

À son arrivée à Québec, Champlain entreprend de s’assurer la loyauté des colons au moyen d’une série de cultes et de cérémonies destinés à renforcer le pouvoir et l’autorité de la couronne française et du christianisme en Nouvelle-France. Il procède également à une inspection minutieuse de la colonie. Il est déçu de l’état déplorable des installations de Québec et s’inquiète de la vulnérabilité de la colonie en cas d’attaque.

Il ordonne aux ouvriers d’amorcer la construction d’une nouvelle fortification, le fort Saint-Louis, de réparer l’entrepôt et de construire une nouvelle habitation pour sa famille. Champlain poursuit activement le développement de l’agriculture dans la colonie et identifie des sites agricoles potentiels sur l’île d’Orléans et le cap Tourmente. Il encourage également les pratiques agricoles parmi les colons et ses alliés montagnais (innus).

Au cours de cette période, Champlain se heurte sans discontinuer au problème du maintien de la paix dans la colonie, dans un contexte de querelles religieuses, culturelles, économiques et politiques. En 1621, il instaure en Nouvelle-France plusieurs lois, qu’il aurait – selon les chercheurs – lui-même élaborées en grande partie. Toutefois, les partisans du libre-échange et de l’ouverture des marchés contestent son autorité au sein de la colonie et continuent de lui poser des problèmes.

Champlain travaille à établir des relations commerciales plus agréables avec les Montagnais (Innus) et à promouvoir la paix avec les nations iroquoises (haudenosaunees), notamment en envoyant plus de jeunes Européens vivre au sein des communautés autochtones en sorte qu’ils acquièrent une meilleure compréhension de leurs langues et leurs cultures.

La femme de Champlain, Hélène, laisse également une impression durable auprès de la colonie et de ses voisins autochtones. Étudiant les langues algonquiennes, elle parvient à communiquer avec les membres des communautés voisines.

Néanmoins, en 1624, après quatre ans passés à Québec, Hélène souhaite retourner en France. Avant de reprendre le chemin du retour avec son ménage, Champlain supervise le début de la construction d’une nouvelle habitation à Québec. Au début du mois d’octobre, lui et Hélène sont de retour en France et s’établissent dans une nouvelle résidence, à Paris. Hélène ne retournera jamais en Nouvelle-France. Au cours des années suivantes, elle assiste Champlain dans ses affaires, mais se consacre de plus en plus à ses intérêts religieux. En 1645, elle entre dans un couvent. Plus tard, elle fonde un monastère dans la ville de Meaux. Elle décédera le 20 décembre 1654.

De retour en France en 1624, Champlain participe à de fructueux entretiens avec le roi et le vice-roi de la Nouvelle-France, qui tous deux soutiennent ses efforts en faveur de la paix, de l’ordre et de la tolérance religieuse en Nouvelle-France sans toutefois partager systématiquement ses méthodes ou sa vision. En 1625, le duc de Montmorency se démet de la vice-royauté de la Nouvelle-France en faveur de son neveu, Henri de Lévis, duc de Ventadour, fervent catholique, qui confirme Champlain dans sa fonction de lieutenant du vice-roi de la Nouvelle-France et lui accorde un pouvoir et une autorité accrus sur la colonie. Champlain demeure en France jusqu’en 1626 et travaille en étroite collaboration avec le nouveau vice-roi afin de régler les questions de commerce et de colonisation.

Le déclin de la Nouvelle-France et le regain de tension entre les Français et leurs voisins autochtones sont portés à la connaissance du vice-roi en 1625. Il devient alors manifeste qu’il est nécessaire de prendre en main la nouvelle colonie. Au printemps 1626, Champlain retourne en Nouvelle-France pour résider de nouveau à Québec.

À son arrivée, il est frappé par le peu de progrès réalisés dans la colonie. D’emblée, il enjoint à ses ouvriers de reprendre les travaux engagés sur l’habitation et d’apporter des améliorations aux fortifications. Puis, il choisit un site d’implantation au cap Tourmente, où il planifie la construction d’une ferme. Au cours de cette période, Champlain s’efforce de maintenir la paix au sein de la colonie et de perpétuer ses bonnes relations avec ses alliés autochtones. Au cours de l’hiver 1627-1628, les Montagnais (Innus) confient à Champlain trois jeunes filles dans l’intention que ces dernières vivent avec les Français et soient instruites dans leur religion, leur langue et leur culture. Ce geste semble avoir amélioré provisoirement les relations entre les deux nations.

Dans le même temps, se déploie en France une forte activité qui aura de grandes implications pour l’avenir de la colonie. De 1620 à 1625, la Compagnie de Montmorency, ou Compagnie de Caen, jouit d’un monopole de la traite des fourrures en Nouvelle-France en retour de son soutien parfois timide aux activités religieuses et coloniales au sein du territoire. En 1626, la compagnie se reforme sous l’autorité du nouveau vice-roi, Ventadour, remplacé en 1627 par le cardinal Richelieu, personnage à l’influence croissante à la cour du roi de France. Richelieu fonde une nouvelle société commerciale, connue sous le nom de Compagnie des Cent-Associés. Dans l’ensemble, les changements survenus en France et les actions engagées par Champlain à Québec assurent la pérennité de la colonie. La nouvelle menace à sa survie ne sera toutefois pas facile à dissiper.