À l’hiver 1607-1608, le sieur de Monts retourne à la cour du roi de France et convainc Henri IV de poursuivre le projet de colonisation en Nouvelle-France et de proroger son monopole de commerce pour une année supplémentaire. Bien que Champlain souhaite vivement retourner dans la vallée du Saint-Laurent, de Monts compte établir une colonie plus au sud. Un compromis est trouvé et, au printemps 1608, deux navires appareillent à destination de la vallée du Saint-Laurent afin d’y fonder un établissement permanent, alors qu’un troisième se dirige vers l’Acadie pour y restaurer l’établissement existant.

Champlain se voit octroyer un poste de commandement de la mission et reçoit le titre de « lieutenant de la Nouvelle-France ». Il fait voile vers Tadoussac le 13 avril 1608 où il rencontre son collègue et ami Pont-Gravé le 3 juin. Plusieurs jeunes hommes font partie du voyage, dont Étienne Brûlé et Nicolas Marsolet, mais l’expédition ne compte aucune femme ni aucun ecclésiastique dans ses rangs.

Peu de temps après son arrivée, Champlain part explorer le Saguenay inférieur avec la permission de ses compagnons montagnais (innus). Ensuite, il remonte le Saint-Laurent afin d’y repérer un site d’établissement permanent, qu’il trouve à un endroit que les Autochtones appellent Kebec, ce qui signifie « où l’eau se rétrécit ». Le 3 juillet 1608 commencent les travaux de construction d’une « habitation », sur le site rebaptisé Québec par les Français.

L’objet de l’établissement est double : intercepter les fourrures transportées vers Tadoussac pour éviter que les marchands concurrents et illégaux ne s’en emparent; et renforcer les alliances avec les Autochtones de la région des Grands Lacs. Les hommes de Champlain travaillent sans relâche pour bâtir l’habitation, aménager des potagers et réaliser les autres tâches nécessaires à la réussite de l’établissement. Toutefois, tous ne sont pas satisfaits des conditions de vie difficiles au sein de la nouvelle colonie. À l’automne 1608, Champlain est avisé qu’il est la cible d’un complot visant à l’assassiner et à détruire l’habitation.

Ce complot est fomenté par Jean Duval, motivé selon toute vraisemblance par la possibilité d’une récompense de la part des concurrents basques espagnols s’opposant à de Monts, qui commercent sur le Saint-Laurent depuis de longues années et ne tolèrent pas le monopole du sieur de Monts. Découvrant ce complot, Champlain fait exécuter le conspirateur, puis renvoie ses complices en France dans les fers.

L’hiver suivant est particulièrement difficile pour les colons du Québec et les Montagnais (Innus). Bon nombre de colons périssent du scorbut et de la dysenterie avant le retour des beaux jours. Les autres membres de la colonie se réjouissent à la vue des premières prises de poisson dans le Saint-Laurent et à l’arrivée des vivres venus de France en juin 1609.